莱布尼茨植物生物化学研究所(IPB)的科学家们首次成功地将大基因片段高效、稳定、精确地插入高等植物的DNA中。为此，他们优化了基因编辑方法CRISPR/Cas，俗称“基因剪刀”。
改进的CRISPR方法为高等植物基因的定向修饰提供了巨大的机会，无论是育种还是研究。该研究由AlainTissier教授和TomSchreiber博士领导，已发表在《MolecularPlant》杂志上。
CRISPR/Cas是一种在个体基因定向修饰方面具有巨大潜力的方法。然而，这并不适用于育种者和科学家愿望清单上的所有类型的基因改造。虽然基因剪刀非常适合敲除基因，即关闭或去除现有基因，但它们不能很好地精确插入基因或替换基因片段。迄今为止，基因剪刀的效率太低，因此对于将基因定向插入高等植物的DNA来说几乎没有用处。
“其原因是植物内部DNA断裂修复机制，”施赖伯说。一旦DNA发生损伤，这些修复酶就会立即出现。它们还能够识别基因剪刀所产生的平滑切口，并立即重新连接双螺旋中被切断的两条DNA链。切割后的DNA粘合在一起的速度非常快，但不是很精确。由于DNA的微小片段丢失或添加，会出现轻微的信息丢失。
“这些不准确性在敲除项目中不是问题，甚至是可取的，”施赖伯说，“因为无论如何我都想关闭基因。但如果我想插入一个基因，就必须非常精确地完成。遗传信息必须准确插入，不能缺少任何一个成分，也不能整合任何一个附加成分，否则基因就失去了功能，整个实验就白费了。”
因此，迄今为止，CRISPR/Cas介导的较大基因或DNA片段的精确且无疤痕插入仅在极少数案例中取得了成功。为了提高基因插入的成功率，哈勒大学的科学家为基因剪刀配备了一种额外的酶，即所谓的核酸外切酶。
核酸外切酶可以改变基因剪刀产生的DNA切割位点，从而使细胞内部修复酶无法再识别和修复DNA损伤。因此，由CRISPR/Cas插入的DNA片段将有足够的时间通过另一种非常精确的细胞修复机制将自身整合到正确的位置。
在实验中，哈勒大学的科学家测试了各种病毒、细菌、植物和人类来源的核酸外切酶，以确定它们增加精确基因插入事件数量的能力。他们将带有相应核酸外切酶和基因X片段的基因剪刀引入烟草植物本塞姆塞姆氏烟草的叶细胞中。
这些烟草细胞之前已经配备了绿色荧光标记基因。它们还含有被破坏的基因X，这是形成绿色荧光染料所必需的。然而，只要X基因的遗传信息有很大一部分缺失，荧光标记就无法产生。
只有使用CRISPR/Cas精确地重新插入X缺失的基因部分，从而修复X基因时，才能产生绿色标记。成功插入基因的每个细胞都会发出绿色荧光，研究人员可以简单地计算基因插入事件的成功率。
所测试的两种核酸外切酶(其中一种来自疱疹病毒家族)被证明特别有效。使用这些技术，来自Halle的团队实现的完美基因插入事件比单独使用CRISPR/Cas提高了38倍。
然后将该实验方法与其他基因进行测试，并在其他植物中进行测试，即拟南芥(Arabidopsisthaliana)和小麦。由于烟草植物中的基因插入仅发生在叶子的局部，因此整合的基因在下一代子代中丢失，因此仅在基因组中存在有限的时间。
这就是为什么在拟南芥和小麦中，HalleCRISPR专家试图将该基因整合到生殖细胞中，以确保植物后代的稳定遗传。在所测试的核酸外切酶的帮助下，稳定的(即可遗传的)基因敲入在拟南芥中取得了成功，其频率增加了十倍;在小麦中，基因敲入的频率增加了1%以上。
“1%乍一听似乎不多，”Schreiber解释道，“但如果育种者想要将某种性状引入他的植物中，他只需要使用我们优化的CRISPR筛选大约50-100个第一代子代植物/Cas方法来寻找具有所需性状的植物，与传统育种方法相比，这将节省大量时间，传统育种方法必须分析500到1,000株植物。”
因此，优化的CRISPR/Cas方法是一种很有前途的工具，可将基因定向插入高等植物，也可能插入其他生物体。例如，将来，植物育种家可以使用这种方法，将野生物种或古老栽培品种中失去的针对病原体的抗性基因重新引入现代高产优良品种中。这样，诸如此类的理想性状就可以增强植物育种，并有助于开发更强大的作物品种。
对于科学而言，这种方法提供了绝佳的机会，可以一步优雅地用经过修饰的植物基因替换某些植物基因。这对于阐明基因功能特别有帮助。